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组织学技术_图

发布日期:2020-05-23 16:15   来源:未知   阅读:

  组织学技术_理学_高等教育_教育专区。实用组织学与细胞化学 研究技术 组织学技术 一 组织学技术的发展与应用 内 容: 组织学制片技术、胚胎学制片技术、组织化学技术、荧光技术、 免疫组化技术、组织培养技术、组织工程技术等。 光学显微镜

  实用组织学与细胞化学 研究技术 组织学技术 一 组织学技术的发展与应用 内 容: 组织学制片技术、胚胎学制片技术、组织化学技术、荧光技术、 免疫组化技术、组织培养技术、组织工程技术等。 光学显微镜技术:特殊显微镜技术(荧光、倒置、相差)、显微 摄影技术等 电子显微镜技术:电镜技术、电镜细胞化学技术等 应 用:Hooke发现细胞,1811年改良了显微镜—组织学基础。 但是,不能看到透明的切片标本。 1851年,发现卡红可染细胞核,1865年,苏木精能染细胞核。 十九世纪20年代Feulgen创立核酸反应。 30年代,相继发明了相差显微镜。 特别是,50年代组织化学与电镜技术迅速发展和提高,组织学技 术进入了新时期。 二 组织切片方法分类 1.切片法:石蜡切片、明胶切片、火棉胶切片、电镜超薄 切片等(微米) 2.涂片法:血液等液体 3.磨片法:骨等坚硬组织 4.分离制片法:分离单个细胞—平滑肌细胞、肝细胞等 5.印片法:肝、脾、淋巴结等 6.活体制片:注射胎盘兰等,观察巨噬细胞的活动 7.超活体染色制片:活体观察精子形态与活动等 8.整体切片法:用大型切片机,人胚、肝、肾、脑等 组织制片技术 普通制片技术—HE切片术 一 基本程序 (一). 动物取材 必须根据科研或教学的目的与要求确定,医学领域以人的 材料为最好,高级动物猴、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠等。 动物麻醉法: 1.吸入麻醉:小鼠、大鼠、豚鼠等。在玻璃缸内进行。 2.注射麻醉法:、乌拉坦等,猴、猫、狗、兔等大型动物,静脉 或腹腔注射。 3. 直接杀死法:小鼠、大鼠、豚鼠等,用金属器械猛击后脑部—第四脑 室区。 取材顺序: 1. 腹腔器官: 肝、胆、胃、肾上腺、胰、脾、 十二指肠、空肠、回肠、结肠等 2.胸腔器官: 心脏、肺 3.盆腔器官: 膀胱、卵巢、输卵管、子宫等 4.神经系统: 大脑、小脑、脊髓等 5.眼球、内耳 (二) 固定 目 的:保持组织内细胞的形态、结构及其化学组成,使与生活时原有形态、 结构及化学组成相似。 1.蛋白质、脂肪、类脂体、酶等沉淀或凝固—抑制自溶。 2.组织内各种不同物质产生不同的折光率,便于显微镜下观察。 3.某些固定剂可起到硬化作用,有利于组织切片:甲醛、乙醇、氯仿等。 4.某些固定剂可起到媒染作用:重铬酸等。 固定具体方法: 1.小块固定法 1×1 × 0.3cm(不超过0.5cm厚)。 2.整体固定法 (小动物——灌流法),效果好。 固定液能迅速渗透到各器官、组织。 具有一定硬度,有利于薄切。 可避免因取材时间过久—保持新鲜状态。 3.蒸汽固定法 用于涂片、印片等(骨髓涂片、淋巴印片)。 固定液:应具有以下性能 1. 对蛋白质、脂肪、类脂体、碳水化合物等具有沉淀、凝固作用。 2. 具有一定穿透力—迅速进入组织。 3. 对组织不引起收缩或膨胀。 4. 对组织产生一定的硬化作用。 5. 具有一定pH值。 6. 对染色无副作用。 常用固定剂: 1. 单纯固定剂: 甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸甲、锇酸等。 甲醛: 常用,pH值为中性。穿透组织速度快,固定均匀,组织收缩小。 它是蛋白质最好的固定剂,在组织化学中广泛应用。 乙醇: 常用的固定剂与保存剂,穿透组织速度快。具有固定、凝固蛋白 质作用,亦具有硬化组织和脱水等作用。 丙酮: 可作固定剂与脱水剂,对某些酶(碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等) 固定效果好。 锇酸: 强氧化剂,不能与甲醛、乙醇等混合。使蛋白胶状固定而不发生 沉淀,为脂肪、类质脂、髓鞘等优良固定剂。目前为电镜标本常用的固定 剂。 2. 混合固定剂 : 甲醛混合固定剂、乙醇混合固定剂、丙酮混合固定剂、 重铬酸甲混合固定剂、锇酸混合固定剂等。 (三) 冲洗 目 的: 1.停止固定液继续对组织的作用。 2.除去组织中多余的固定剂,以免影响染色。 方 法: 1. 简易流水冲洗法。 2. 系列玻璃瓶或水槽冲洗法。 (四)脱水 目 的: 1. 除去组织中含有的水分—脱水。 2. 脱水后便于石蜡包埋等。 脱水剂:乙醇、丙酮、正丁醇等。 方 法:由低浓度逐渐升高浓度,以避免组织收缩。 2~3mm 5mm 50%Alc 6~8h 6~12h 70% 6~8h 6~12h (过夜) 80% 95%(Ⅰ) 95%(Ⅱ) 100%(Ⅰ) 100%(Ⅱ) 4~6h 2~4h 2~4h 1~2h 1~2h 6~8h 3~6h 3~6h 2~4h 2~4h (五) 组织透明 乙醇不能与石蜡混合,需要经过一种乙醇与石蜡之间媒 浸物,即透明剂。透明剂可能取代乙醇而使组织呈透明 状,而液态石蜡则可取代透明剂乙醇进入组织。当液态 石蜡形成固态之后,便于薄切。 常用透明剂: 二甲苯 易挥发,折光率1。497,沸点144,透明力强。 此外,甲苯、苯、氯仿、丁香油等。 步 骤: 1.先二甲苯:纯乙醇(1:1) 2.二甲苯 (六) 包埋 1.渗蜡(浸蜡): 重要步骤。熔化为液态的 石蜡透过组织间隙进入到组织中。 步骤:(1)软蜡:熔点54~560C 透蜡 (2)硬蜡:熔点56~580C 渗蜡 以上均在温箱中进行。 不能超过600C,否则变脆、收缩。 2. 包埋: 硬蜡 60~620C (七) 切片 切片机:回转切片机、滑动切片机、冷冻切片机等 切片是整个制片过程中关键的步骤(切片厚度:4~6μm) (八) 切片贴展 将薄切的切片贴附载玻片上 要 求: 1.牢固,染色时不能脱落。 2.展开皱褶,不影响将来的观察。 (九) 染 色 染 料: 根据染料的来源分为天然染与人工染料两种。 染色化学性质分为弱酸性、强酸性、弱碱性、强碱性及中性。 依染色对象分为胞核染料与胞质染料。 1.染料的来源 天然染料: 为天然产物,从动物或植物体中提取的 苏木精 从苏木树的树心中提炼出来的—为优质的细胞核染料。 胭脂红(卡红) 雌性介壳虫(胭脂虫)中加工而得—染色质 着色最佳。 地衣红(俄西印) 地衣纲质物(茶荠地衣)中提取—弹 性纤维染料。 人工合成染料: 由芳香环或具有芳香环性质的杂环化合物所构成。 硝基类(苦味酸): 胞浆染料 醌型苯环类: 甲基绿、甲基紫、酸性复红、水溶性苯胺兰、孔雀绿、 亮绿等。 丫叮染料: 伊红丫、丫叮黄等。 醌亚胺类染料: 美兰、甲苯胺兰、硫堇、中性红等。 偶氮类染料: 偶氮卡红、桔黄G、苏丹Ⅲ、刚果红、胎盘兰等。 (十)封片 HE染色的步骤与方法 染色步骤: 1.切片脱蜡 二甲苯 5~10分钟 2.切片从而甲苯中取出,无水乙醇中1~3分钟,洗去石蜡和二甲苯 3.切片浸入95%乙醇中1~3分钟,组织切片呈白色 4.切片浸入80%乙醇中1~2分钟,逐步降低乙醇浓度 5.切片经lugol氏碘乙醇3~5分钟,除去组织中的汞盐沉淀 6.普通水冲洗碘液 7.金如5%硫代硫酸钠1~2分钟,洗去棕色 8.普通水----蒸馏水漂洗,以备染色 9.切片入苏木精染色,10~15分钟 10.水洗 11. 切片经盐酸-酒精分色10~20秒.此为苏木精染色个关键----细胞核染成深蓝色 12. 充分水洗(注意:不要洗掉切片!) 13. 0.5~1%伊红染胞质3~10分钟,淡红色即可 14. 95%乙醇中分色1~3分钟,洗去切片上多余的伊红 15. 95%乙醇中继续分色1~3分钟 16. 100%乙醇中脱水鉴别2~3分钟 17. 100%乙醇中完全脱水2~3分钟 18. 立即二甲苯中透明3~5分钟 19. 中性树胶封片 20. 镜检染色结果:细胞核----深蓝色,细胞质----红色,结缔组织为淡红色, ? 肌纤维为红色,胶原纤维为红色,软骨组织为深蓝色,红细胞为桔红色 涂片:血液等 铺片:疏松结缔组织、肠系膜等 磨片:骨、牙等 人工假象:凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、 褶、色素沉着等。 几种特殊显微镜: 1.相差显微镜 观察组织活细胞,标本不染色,反差小。 2.倒置显微镜 目镜在下,光源在上,观察瓶底培养的活细胞。 人工假象 小 结: 1。简述HE切片制备的大体程序? 2。组织切片有几种方法? 3。简述组织取材的大体顺序? 谢 谢!

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